PENENTUAN KADAR KLOROFIL SECARA SPEKTROSKOPI

ABSTRAK

Praktikum ini memiliki tujuan utama yaitu untuk mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektofotometer. Dimana untuk keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam penggunaan Spektofotometer ini. Spektofotometer yang akan digunakan dalam praktikum ini adalah BAUSCH & LOMB SPECTRONIC 20 SPECTROPHOTOMETER. Parameter yang dianalisis adalah kandungan klorofil a, dan klorofil b, serta klorofil total. Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Rumus empiris klorofil adalah C55H72O5N4Mg (klorofil a) dan C55H70O6N4Mg (klorofil b). Klorofil a dan b berperan dalam proses fotosintesis tanaman. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Salah satu cara untuk dapat menentukan kadar klorofil adalah dengan metoda spektofotometri. Dari hasil pengukuran dengan spektrofotometer, daun tengah memiliki kandungan klorofil yang paling tinggi dibanding daun muda dan daun tua. Sedangkan kadar klorofil terendah dimiliki oleh daun muda. Karena pada daun muda, daunnya masih berwarna hijau muda.

Kata kunci: klorofil, spektrofotometer, daun, dan fotosintesis

LATAR BELAKANG

Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman, Algae dan Cynobacteria. Nama "chlorophyll" berasal dari bahasa Yunani kuno : choloros= green (hijau), and phyllon= leaf (daun). Fungsi krolofil pada tanaman adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat (gula menjadi pati), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar matahari (Subandi, 2008).

Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sintesis molekul makanan dalam kloroplas. Kloroplas ditemukan terutama dalam sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut stomata (Campbell, dkk., 2002).

Kloroplas berasal dari proplastid kecil (plastid yang belum dewasa, kecil dan hampir tak berwarna, dengan sedikit atau tanpa membran dalam). Pada umumnya proplastid berasal hanya dari sel telur yang tak terbuahi, sperma tak berperan disini. Proplastid membelah pada saat embrio berkembang, dan berkembang menjadi kloroplas ketika daun dan batang terbentuk. Kloroplas muda juga aktif membelah, khususnya bila organ mengandung kloroplas terpajan pada cahaya. Jadi, tiap sel daun dewasa sering mengandung beberapa ratus kloroplas. Sebagian besar kloroplas mudah dilihat dengan mikroskop cahaya, tapi struktur rincinya hanya bias dilihat dengan mikroskop elektron (Salisbury dan Ross, 1995).

Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b. Perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol. (Santoso, 2004).

Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah sekitar 1% basis kering. Dalam daun klorofil banyak terdapat bersama-sama dengan protein dan lemak yang bergabung satu dengan yang lain. Dengan lipid, klorofil berikatan melalui gugus fitol-nya sedangkan dengan protein melalui gugus hidrofobik dari cincin porifin-nya. Rumus empiris klorofil adalah C55H72O5N4Mg (klorofil a) dan C55H70O6N4Mg (klorofil b) (Subandi, 2008).

Klorofil a dan b berperan dalam proses fotosintesis tanaman. Klorofil b berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis (Taiz dan Zeiger, 1991).

Faktor-faktor yang berpengaruh terhadap pembentukan klorofil antara lain gen, bila gen untuk klorofil tidak ada maka tanaman tidak akan memiliki klorofil. Cahaya, beberapa tanaman dalam pembentukan klorofil memerlukan cahaya, tanaman lain tidak memerlukan cahaya. Unsur N, Mg, Fe merupakan unsur-unsur pembentuk dan katalis dalam sintesis klorofil. Air, bila kekurangan air akan terjadi desintegrasi klorofil. (Subandi, 2008).

Daun dari kebanyakan spesies menyerap lebih dari 90 % cahaya ungu dan biru, demikian pula untuk cahaya jingga dan merah. Hampir seluruh penyerapan ini dilakukan oleh pigmen-pigmen pada kloroplas. Pada membran tilakoid, setiap foton dapat mengeksitasi satu elektron dari pigmen karotenoid atau klorofil. Klorofil berwarna hijau merupakan bukti bahwa pigmen ini tidak efektif untuk menyerap cahaya hijau. Cahaya hijau oleh klorofil dipantulkan atau diteruskan (Lakitan, 2007).

Sel penutup memiliki klorofil di dalam selnya sehingga dengan bantuan cahaya matahari akan sangat berpengaruh buruk pada klorofil. Larutan klorofil yang dihadapkan pada sinar kuat akan tampak berkurang hijaunya. Daun-daun yang terkena langsung umumnya akan tampak kekuning-kuningan, salah satu cara untuk dapat menentukan kadar klorofil adalah dengan metoda spektofotometri (Dwijoseputro, 1995).

Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan fotometer akan menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang punya spesifikasi melewati banyaknya panjang gelombang tertentu (Noggle dan Fritz, 1979).

Nama pigmen	Warna Klorofil
Klorofil a	Kuning - Hijau
Klorofil b	Blue - Green
Karotin	Jeruk
Xanthophyll	Kuning

Penghitungan kandungan klorofil (mg/L) ditentukan dengan rumus :

Klorofil a = 1.07 (OD 663) – 0.094 (OD 644)

Klorofil b = 1.77 (OD 644) – 0.28 (OD 663)

Klorofil total = 0.79 (OD 663) + 1.076 (OD 644) (Setiari, dkk., 2009).

Klorofil atau pigmen utama tumbuhan banyak dimanfaatkan sebagai food suplement yang dimanfaatkan untuk membantu mengoptimalkan fungsi metabolik, sistem imunitas, detoksifikasi, meredakan radang (inflamatorik) dan menyeimbangkan sistem hormonal (Limantara, 2007).

Praktikum ini memiliki tujuan utama yaitu untuk mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektofotometer. Dimana untuk keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam penggunaan Spektofotometer ini. Spektofotometer yang akan digunakan dalam praktikum ini adalah BAUSCH & LOMB SPECTRONIC 20 SPECTROPHOTOMETER. Parameter yang dianalisis adalah kandungan klorofil a, dan klorofil b, serta klorofil total.

MATERIAL DAN METODE

A.    Alat dan bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah bayam (Amaranthus sp), aseton 60% dan 80%. Dan alat yang digunakan berupa mortar dan alu, gelas ukur, labu ukur, tabung reaksi, spektrofotometer Genesys 10.

B.     Metode

Untuk percobaan pengukuran kadar klorofil dilakukan percobaan mengukur kadar klorofil dari suatu tanaman yang umurnya berbeda-beda. Untuk memperoleh umur yang berbeda ini diambil patokan :

1.      Daun umur muda diambil daunnya pada pucuk

2.      Daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk

3.      Daun dewasa diambil daun nomor 5 ke bawah

Untuk membandingkan kadar klorofil dari daun-daun tadi digunakan cara pengukuran yang dilakukan oleh Arnon (1949) yaitu, 1 gram daun yang masih segar dirajang kecil-kecil. Rajangan diekstrak dengan aseton 60% sebanyak 100 mL, dengan cara menggerusnya didalam mortal selama 5 menit. Diyakinkan bahwa semua pigmen klorofil dari daun telah keluar seluruhnya dan hal ini dapat dilihat dari ampasnya yang berwarna putih. Ekstrak klorofil disaring dengan saringan Buchner dan selanjutnya dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml. Penambahan aseton 80% hanya diperlukan apabila volume ekstrak dalam labu ukur belum mencapai batas 100 ml. Dengan menggunakan cuvet, Optica Dencity (OD) diukur dari ekstrak dengan menggunakan panjang gelombang 663 nm dan 645 nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan membandingkan OD pada 663 nm dan 645 nm dalam sel yang tebalnya 1 cm dengan menggunakan koefisien absorbsi spesifik yang telah ditentukan oleh Mac Kinner (1941) sebagai berikut :

Klorifil total (mg/l)      = 20,2 D₆₄₅ + 0.02 D₆₆₃

Klorofil a                     = 12,7 D₆₆₃ + 2,69 D₆₄₅

Klorofil b                    = 22,9 D₆₄₅ + 0,02 D₆₆₃

HASIL PENGAMATAN

Tabel 1

Jenis Daun	λ = 645 nm		λ = 663 nm
	Absorban	K x ABS	Absorban	K x ABS
Daun muda	0,214	0,2135	0,266	0,2661
Daun Tengah	0,221	0,2206	0,553	0,5527
Daun Tua	0,151	0,1506	0,317	0,3170

Tabel 2

Kandungan klorofil	Daun muda	Daun tengah	Daun tua
Klorofil a	3,95386	7,61759	4,43209
Klorofil b	4,90592	5,07196	3,46424
Klorofil total	4,32812	4,47526	3,05654

Keterangan:

1.      Daun tua

2.     

2

3

1

Daun tengah

3.      daun muda

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pengamatan penentuan kadar klorofil pada sayuran bayam (Amaranthus sp) secara Spektroskopi. Berdasarkan literatur, bayam memiliki kandungan klorofil yang cukup tinggi yaitu untuk kandungan klorofil total 23.0222, klorofil a 18.2622 dan klorofil b 4.7700.  Kandungan klorofil ini cukup tinggi dibanding sayuran lain seperti kangkung. Pada praktikum ini dilakukan pngamatan terhadap tiga jenis daun pada bayam berdasarkan perbedaan umurnya yaitu daun muda (pucuk daun), daun setengah tua (daun urutan ketiga dari pucuk) dan daun tua (daun urutan kelima dari pucuk).

Sebelumnya dilakukan ekstraksi pada ketiga jenis daun tersebut. Selanjutnya menghitung kadar klorofil dengan menggunakan spektrofotometer. Alat yang digunakan untuk mengamati kadar klorofil pada praktikum ini yaitu Spectronic 20 Spektrofotometer. Prinsip kerjanya adalah menentukan kadar klorofil dengan spektrum cahaya (panjang gelombang) tertentu yang dipancarkan ke molekul klorofil didalam alat tersebut. Senyawa tertentu hanya menyerap foton yang bersesuaian dengan panjang gelombang tertentu dan oleh karena itu setiap pigmen memiliki spektrum absorbsinya yang unik. Klorofil a dan klorofil b karena memiliki absorbsi spektrumnya yang kuat pada kisaran panjang gelaobang 600-700 nm. Klorofil-a (C₅₅H₇₂O₅N₄Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil-b (C₅₅H₇₀O₆N₄Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil-a dan b paling kuat menyerap cahaya di bagian merah (600-700 nm), sedangkan yang paling sedikit cahaya hijau (500-600 nm).

a.       Daun muda

Daun muda dari Amaranthus sp umumnya memiliki warna yang lebih muda dibandingkan dengan daun setengah tua dan daun dewasa serta memiliki kandungan klorofil yang berbeda-beda. Setelah dilakukan pengukuran terhadap konsentrasi klorofilnya pada tabel 2 diperoleh klorofil a sebesar 3,95386 mg/l dan klorofil b sebesar 4,90592 mg/l. adapun klorofil totalnya adalah 4,32812 mg/l. Hal ini menunjukan bahwa jumlah klorofil terbanyak pada daun muda adalah klorofil b.

b.       Daun setengah tua

Pada daun setengah tua yang berwarna hijau tua ternyata  mengandung klorofil total dengan konsentrasi 4,47526 mg/l dan klorofil a 7,61759 mg/l serta klorofil b 5,07196 mg/l. Dari hasil tersebut ternyata yang mendominasi adalah klorofil a dengan konsentrasi tertinggi. Dibandingkan dengan daun muda, jumlah klorofil pada daun setengah tua jauh lebih besar. Hal ini dikarenakan adanya peningkatan secara signifikan pada jumlah klorofilnya sehingga proses fotosintesis tentunya dapat berjalan lebih optimal.

3. Daun dewasa

Pada daun dewasa umumnya memiliki warna lebih hijau tua. Hasil pengukuran konsentrasi klorofil yang terkandung di dalam daun ini diperoleh untuk klorofil total sebesar 3,05654 mg/l, klorofil a 4,43209 mg/l dan klorofil b 3,46424 mg/l. Jumlah klorofil b lebih kecil dibandingkan dengan klorofil a. Jumlah klorofilnya jauh lebih kecil dari pada daun muda dan setengah tua. Hal ini disebabkan oleh penuaan dan sedikit demi sedikit jumlah klorofil terus berkurang hingga akhirnya daun tersebut gugur (absisi). Berkurangnya jumlah klorofil menyebabkan efektifitas fotosintesisnya berkurang.

Menurut Subandi (2008), semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan klorofil b. Klorofil a terdapat sekitar 75 % dari total klorofil. Begitu juga jika klorofil a dijumlahkan dengan klorofil b, hasilnya berbeda dimana klorofil totalnya lebih besar  dari pada hasil yang didapatkan dengan perhitungan menggunakan rumus perbandingan optical density. Perbedaan ini mungkin saja terjadi karena adanya  pigmen klorofil lain selain pigmen klorofil a dan b.

            Berdasarkan pengamatan pada tabel 2 dapat dilihat bahwa daun tengah mengandung pigmen klorofil total yang paling tinggi dibanding daun muda dan daun tua. Sedangkan kadar klorofil total terendah dimiliki oleh daun tua. Akan tetapi, daun tua memiliki kadar klorofil a yang lebih tinggi dari daun muda. Pada daun muda, daunnya hijau muda. Warna ini ditentukan oleh klorofil b yang terkandung didalamnya lebih besar dari daun tua. Sedangkan pada daun tengah daun berwarna hijau tua. Warna ini ditentukan oleh pigmen klorofil a. Sedangkan untuk daun yang tua, warnanya juga tidak jauh berbeda dengan daun tengah, karena posisinya yang masih berdekatan. Untuk daun tua yang warnanya hampir menguning, pigmen dominan adalah xantofil (Subandi, 2008).

KESIMPULAN

            Pengukuran jumlah klorofil dapat dengan dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer BAUSCH & LOMB SPECTRONIC 20 SPECTOPHOTOMETER dan dibutuhkan  keterampilan dan pengetahuan khusus dalam penggunaannya. Pada daun yang masih muda konsentrasi klorofil masih rendah, sedangkan daun setengah tua sangat tinggi dan menurun drastis pada  daun dewasa akibat penuaan. Tingginya konsentrasi klorofil menunjukkan tingginya penyerapan energi cahaya oleh daun itu sendiri. Semakain tinggi penyerapan cahaya pada daun  maka semakin maksimal kinerja dalam proses fotosintesisnya.

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, dkk. 2002 Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta : Erlangga.

Dwijoseputro, D. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 2. Jakarta : Gramedia.

Lakitan, Benyamin. 2007. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta : PT. Raja Grafindo Persada.

Limantara L. 2007. Mengapa Kita Butuh Makanan Tambahan / Food Suplemen? (http://pengobatan.wordpress.com/2007/04/14/mengapa-kita-butuh-makanan-tambahanfood-suplemen/) (Diakses tanggal 29 Mei 2011).

Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi : Mall of India Private Ilmited.

Salisbury, J.W. dan Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 2. Bandung : ITB.

Salisbury, J.W. dan Ross. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid I. Bandung : ITB.

Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu : Universitas Muhammadiyah Bengkulu.

Setiari, Nintya  dan  Yulita Nurchayati. 2009. Eksplorasi Kandungan Klorofil pada beberapa sayuran Hijau sebagai Alternatif Bahan Dasar Food Supplement. BIOMA, Juni 2009 Vol. 11, No. 1, Hal. 6-10 (15 Mei 2011).

Subandi, Aan. 2008. Metabolisme (http://metabolisme.blogspot.com/2007/09) (29 Mei 2011).

Taiz L. and E. Zieger. 1998. Plant Physiology. Sinauer Associates Inc., Publisher. Sunderland. Massachusetts.